(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111649190.6 (22)申请日 2021.12.3 0 (71)申请人 上海艾棵颂生物科技有限公司 地址 201306 上海市浦东 新区中国(上海) 自由贸易试验区临港新片区新杨公路 860号10幢 (72)发明人 何建氢　汪洪　 (74)专利代理 机构 上海科盛知识产权代理有限 公司 312 25 代理人 褚明伟 (51)Int.Cl. C12N 5/09(2010.01) A61K 47/46(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体及 其制备方法与应用 (57)摘要 本发明涉及无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来 源外泌体及其制备方法与应用。 向来源于脑胶质 瘤细胞的外泌体悬液中加入皂素， 进行孵育， 使 外泌体内部所携带的RNA和蛋白扩散出外泌体， 清除外泌体内容物； 收集皂素处理后的外泌体， 即获得无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体。 与现有技术相比， 本发明首次获得了无促瘤功能 的胶质瘤细胞外泌体； 本发明涉及的无促瘤功能 的胶质瘤细胞外泌体具有优异的生物 安全性， 可 作为安全、 高效的胶质瘤化疗药物 递送载体进行 应用； 本发 明涉及的无促瘤功能的胶质瘤细胞外 泌体制备方法简单、 成本低， 适用于规模化 生产。 权利要求书1页 说明书7页 附图4页 CN 114369575 A 2022.04.19 CN 114369575 A 1.一种无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体的制备方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 向来源于脑胶质瘤细胞的外泌体悬液中加入皂素， 进行孵育， 使外泌体内部所携带的 RNA和蛋白扩散出外泌体， 清除外泌体内容物； 收集皂素处 理后的外泌体， 即获得 无促瘤功能的脑胶质瘤 细胞来源外泌体。 2.根据权利要求1所述的一种无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体的制备方法， 其 特征在于， 所述脑胶质瘤 细胞选自胶质瘤 细胞系U87、 U251或GL26 0中的一种或几种； 或， 所述脑胶质瘤 细胞来源于基于其 他目的或需求而 脱离于人体的脑胶质瘤 细胞。 3.根据权利要求1所述的一种无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体的制备方法， 其 特征在于， 来源于脑胶质瘤细胞的外泌体悬液中， 外泌体浓度范围为1 ×107/mL～1×1012/ mL， 优选为1 ×1010/mL。 4.根据权利要求1所述的一种无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体的制备方法， 其 特征在于， 向来源于脑胶质瘤细胞的外泌体悬液中加入皂素 的量为： 皂素在外泌体悬液中 的质量浓度为2％～5％， 皂素的质量浓度优选为2.5％。 5.根据权利要求1所述的一种无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体的制备方法， 其 特征在于， 向来源于脑胶质瘤细胞的外泌体悬液中加入皂素后， 孵育的条件为： 4℃～50℃ 条件下震荡孵 育1min～5h； 孵育温度优选为37℃， 孵 育时间优选为1h 。 6.根据权利要求1所述的一种无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体的制备方法， 其 特征在于， 收集皂素处理后的外泌体的方法为： 用生物相容性介质稀释皂素处理后的外泌 体悬液， 再利用差速离心、 密度梯度离心、 超滤、 体积排阻色谱或切向流超滤方法中的一种 或几种的组合 来收集并提纯稀释液中的外泌体。 7.一种基于权利要求1 ‑6中任一项所述方法获得的无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外 泌体， 其特征在于， 所述无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体中不携带脑胶质瘤细胞所 携带的大部分RNA和蛋白。 8.一种如权利要求7所述的无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体的应用， 其特征在 于， 所述无促瘤功能的脑胶质瘤 细胞来源外泌体作为制备治疗脑胶质瘤药物的应用。 9.根据权利要求8所述的无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体的应用， 其特征在于， 所述无促瘤功 能的脑胶质瘤细胞来源外泌体作为负载脑胶质瘤治疗药物的纳米药物递送 载体。 10.一种脑胶质瘤治疗药物， 其特征在于， 包括权利要求7所述的无促瘤功能的脑胶质 瘤细胞来源外泌体， 以及所述无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体内负载的脑胶质瘤治 疗药物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114369575 A 2无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源外泌体及其制备方 法与应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 尤其是涉及一种无促瘤功能的脑胶质瘤细胞来源 外泌体及其制备 方法与应用。 背景技术 [0002]脑胶质瘤是中枢神经系统发病率最高的恶性肿瘤， 占颅内肿瘤总数的35％～ 60％， 其恶性程度高、 复发率高且致死性强， 严重危害患者的生命安全。 世卫组织公布的数 据显示， 恶性脑胶质瘤是导致54岁人以下人群死亡的第3原因。 此外， 脑胶质瘤细胞浸润性 强， 外科手术无法彻底切除肿瘤部位， 且血脑屏障严重抑制 了化疗药物功能的发挥。 因此， 脑胶质瘤的有效治疗一直是临床中的挑战性难题。 目前， 基于纳米材料构建的药物递送载 体可以为脑胶质瘤的治疗提供有效的跨血脑屏障药物递送工具， 是脑胶质瘤治疗的热点研 究方向， 具有重要的临床应用潜力。 [0003]外泌体是由细胞分泌的直径30～150nm左右的磷脂双层膜囊泡， 负责细胞间的物 质通讯， 是天然的分子递送纳米载体。 相比于人工合成纳米材料， 外泌体具有免疫豁免能 力、 丰富的生物学功能(细胞识别等)、 高效的药物递送 率和优异的跨生物屏障能力， 是 理想 的纳米药物递送载体。 目前， 一些细胞分泌的外泌体已进行靶向工程化修饰实现了负载药 物的跨血脑屏障递送， 并进一步用于胶质瘤或阿尔 茨海默症的药物干预与治疗， 具有一定 的应用潜力。 然而， 外泌体的工程化修饰过程复杂、 成本高， 且批次间差异大， 目前不具备工 程化生产条件。 [0004]近年来， 肿瘤细胞分泌的外泌体在化疗药物递送中得到了广泛的关注与研究。 相 比于其他细胞来源的外泌体， 这些外泌体具有以下优势： 1、 可识别特定肿瘤细胞， 无需进 行 工程化修饰即可实现肿瘤部位的高效靶向富集； 2、 可激活机体抑癌免疫反应。 另外， 鉴于肿 瘤细胞强大的增殖的能力， 可快速实现自体肿瘤细胞分泌外泌体的规模化生产。 因此， 鉴于 以上优势， 肿瘤细胞来源的外泌体是理想的化疗药物靶向递送的纳米载体， 具有重要的临 床应用价值。 目前， 胶质瘤细胞来源外泌体已经被证实在未进行工程化修饰时具有高效的 脑胶质瘤富集能力， 是一种极具潜力的胶质瘤化疗 药物递送载体。 然而， 大量研究报道证实 肿瘤细胞分泌的外泌体所携带的部 分来源于母体细胞的物质具有促进肿瘤生长、 促进肿瘤 细胞迁移或加速肿瘤微环境构建的功能。 因此， 其实际的临床应用面临着严峻的生物安全 性问题。 发明内容 [0005]为充分发挥胶质瘤细胞外泌体递送载体的优势， 并克服这些外泌体潜在的促瘤风 险， 本发明提供一种无促瘤功能的脑胶质瘤 细胞来源外泌体及其制备 方法与应用。 [0006]本发明要解决的核心技术问题是胶质瘤细胞作为高效靶向纳米药物递送载体的 生物安全性问题。 [0007]肿瘤细胞分泌的外泌体所携带的来源于母体细胞的RNA和蛋白质等物质是其促进说　明　书 1/7 页 3 CN 114369575 A 3