(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111656850.3 (22)申请日 2021.12.3 0 (71)申请人 苏州大学 地址 215006 江苏省苏州市相城区济学路8 号 (72)发明人 汪勇　魏超刚　张锐　潘鹏　 魏兰懿　张乐帅　王杨云　沈钧康　 (74)专利代理 机构 苏州谨和知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 32295 代理人 唐静芳 (51)Int.Cl. A61K 47/52(2017.01) A61K 47/62(2017.01) A61K 47/69(2017.01) A61K 48/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) C12Q 1/6816(2018.01) (54)发明名称 磷酸钙纳米载药体系及其制备方法与应用 (57)摘要 本申请涉及一种磷酸钙纳米载药体系及其 制备方法与应用， 其包括： S1、 提供Ca2+、 Tat溶 液、 Cas9溶液和sgRNA溶液， 将所述Ca2+和Tat溶 液混合得到第一溶液， 将所述Cas9溶液和sgRNA 溶液混合得到第二溶液； S2、 混合所述第一溶液 和第二溶液， 分离沉淀得到磷酸钙纳米载药体 系。 此方法制备过程无任何聚合物及表面活性剂 添加， 保护了CRISPR/Cas9系统结构完整性， 且具 有高生物安全性及负载效率 等特点。 权利要求书1页 说明书5页 附图5页 CN 114288415 A 2022.04.08 CN 114288415 A 1.一种磷酸钙纳米载 药体系的制备 方法， 其特 征在于， 包括： S1、 提供Ca2+、 Tat溶液、 Cas9溶液和sgRNA溶液， 将所述Ca2+和Tat溶液混合得到第一溶 液， 将所述Cas9溶 液和sgRNA溶 液混合得到第二溶 液； S2、 混合所述第一溶 液和第二溶 液， 分离沉淀得到磷酸钙纳米载 药体系。 2.如权利要求1所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法， 其特征在于， 所述Ca2+来自 CaCl2溶液， 所述CaCl2溶液的浓度为0.7～0.9 mol/L； 和/或， 所述Tat溶液的浓度为0.6 ×10 ‑3～0.8×10‑3mol/L。 3.如权利要 求2所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法， 其特征在于， 所述CaCl2溶液的 浓度为0.831mo l/L； 和/或， 所述Tat溶 液的浓度为0.69 ×10‑3mol/L。 4.如权利要求1所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法， 其特征在 于， 将所述Ca2+和Tat 溶液混合得到第一溶 液， 包括： 将所述Ca2+与Tat溶液充分混合， 其中， 反应温度为25～3 0℃， 反应时间为1～ 2h。 5.如权利要求1所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法， 其特征在于， 将所述C as9溶液 和sgRNA溶 液混合得到第二溶 液， 包括： 将Cas9与sgRNA进行混合， 其中， 反应温度为25～3 0℃， 反应时间为0.5～1h 。 6.如权利要求5所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法， 其特征在于， 所述Cas9与 sgRNA以摩尔比1:1的反应比例进行混合。 7.如权利要求1所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法， 其特征在于， 步骤S2具体包 括： 将所述第一溶 液和第二溶 液在25～3 0℃下充分 混合， 反应1～ 2h后， 得到悬 浊液； 将所述悬浊液离心分离， 弃去上清液， 将下方沉淀复溶， 得到所述磷酸钙纳米载药体 系。 8.如权利要求1所述的磷酸钙纳米载药体系的制备方法， 其特征在于， 所述Tat溶液包 括Tat粉末和分散介质， 所述Tat粉末与所述sgRNA的摩尔比为25:1。 9.根据权利要求1至8中任一项所述的制备方法得到的磷酸钙纳米载药体系， 其特征在 于， 在所述磷酸钙纳米载 药体系中， Ca与RNP的质量比为10～5 0:1。 10.根据权利要求9所述的磷酸钙纳米载 药体系在制备基因诊断与治疗产品中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114288415 A 2磷酸钙纳米载药 体系及其制备方 法与应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种磷酸钙纳米载 药体系及其制备 方法与应用， 属于纳米材 料领域。 背景技术 [0002]磷酸钙(CaP)包括羟基磷灰石具有良好的生物相容性， 主要原因是因为它是自然 界和脊椎动物硬组织中的主要 无机成分， 因此， 磷酸钙 被广泛应用于生物医学领域， 如硬组 织缺损修复和替换、 药物和 基因载体、 医学成像等。 此外， 磷酸钙纳米结构具有的pH响应降 解性及高效装载能力和持续释放性能， 也迅速成为具有良好前景的输送药物/基因/蛋白质 的纳米载体。 本项研究着重关注于磷酸钙纳米载药体系 递送CRISPR/Cas9基因编辑技术方 面的研究。 [0003]在现有的非病毒纳米载体 应用于基因治疗的研究中， 已有下述相关报道： [0004]1)Biomaterials  Feb； 28(6):1267 ‑79报道了通过优化Ca/P化学计量以及Ca2+和 PO43‑溶液的混合模式， 合成了纳 米级和单分散的CaP‑pDNA(质粒D NA)杂交纳 米颗粒。 但是核 酸/Cap混合纳米结构材 料合成的传统共聚策略具有生长不受控制以及聚集的缺 点 [0005]2)J Control Release 2011 Feb 28； 150(1):87 ‑93报道了一种无表面活性剂的 方法， 通过使用PEG双磷酸盐作为稳定剂来稳定DNA/Cap纳米颗粒。 二磷酸盐和Cap之间的相 互作用形成稳定和生物可吸收的粒子形成， 颗粒大小约为200nm。 与无需使用PEG双磷酸盐 制备的对照样本相比， 二磷酸盐稳定DNA/Cap纳米颗粒在几天内表现出更好的分散性和稳 定性。 但是， 这一类聚合物无机纳米载体的共性就是合成步骤较复杂， 为材料的合成带来许 多不确定因素。 [0006]就目前而言， 钙基纳 米颗粒应用于非病毒载体仍有问题亟待解决， 如合成复杂、 分 散性薄弱等， 对其是否可以用于 工业化生产至关重要。 发明内容 [0007]本发明的目的在于提供一种磷酸钙纳米载药体系及其制备方法与应用， 此方法制 备过程无任何聚合物及表 面活性剂添加， 保护了CRISPR/Cas9系统结构完整性， 且 具有高生 物安全性及负载效率 等特点。 [0008]为达到上述目的， 本发明提供如下技术方案： 一种磷酸钙纳米载药体系的制 备方 法， 其包括： [0009]S1、 提供Ca2+、 Tat溶液、 Cas9溶液和sgRNA溶液， 将所述Ca2+和Tat溶液混合得到第 一溶液， 将所述Cas9溶 液和sgRNA溶 液混合得到第二溶 液； [0010]S2、 混合所述第一溶 液和第二溶 液， 分离沉淀得到磷酸钙纳米载 药体系。 [0011]进一步地， 所述Ca2+来自CaCl2溶液， 所述CaCl2溶液的浓度为0.7～0.9mol/L； 和/ 或， 所述Tat溶 液的浓度为0.6 ×10‑3～0.8×10‑3mol/L。 [0012]进一步地， 所述CaCl2溶液的浓度为0.831mol/L； 和/或， 所述Tat溶液的浓度为 0.69×10‑3mol/L。说　明　书 1/5 页 3 CN 114288415 A 3