(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111587886.0 (22)申请日 2021.12.23 (71)申请人 中国科学院苏州纳米技 术与纳米 仿 生研究所 地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区 独墅湖高教区若水路398号 (72)发明人 袁鑫　朱毅敏　刘翠娟　 (74)专利代理 机构 南京利丰知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 32256 代理人 王茹 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/85(2006.01)A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 能够特异 性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体、 其表达基因、 其修饰的NK细胞及应用 (57)摘要 本发明公开了一种能够特异性靶向肿瘤细 胞的嵌合抗原受体、 其表达基因、 其修饰的NK细 胞及应用。 所述嵌合抗原受体包括依次连接的胞 外抗原结合结构域、 跨膜结构域和共刺激信号结 构域， 其中， 所述胞外抗原结合结构域包含能够 特异性靶向结合肿瘤细胞或病原的多肽。 本发明 所构建的能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原 受体及其修饰的NK细胞能特异性识别肿瘤细胞， 激活NK细胞并产生细胞毒作用。 此外， 该特异性 靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体中的多肽筛选工 艺简单， 实验室条件下能够筛选出具有针对肿瘤 细胞高亲和 力和特异性靶向作用的多肽， 且可以 将多个多肽进行融合构建成为多价 ‑CAR‑NK， 提 高CAR‑NK对肿瘤细胞的特异性和靶向性。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图7页 CN 114249834 A 2022.03.29 CN 114249834 A 1.一种能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体， 其特征在于， 所述嵌合抗原受体包 括依次连接的胞外抗原结合结构域、 跨膜结构域和共刺激信号结构域， 其中， 所述胞外抗原 结合结构域包 含能够特异性靶向结合肿瘤 细胞或病原的多肽。 2.根据权利要求1所述的能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体， 其特征在于： 所述 胞外抗原结合结构域的蛋白多肽序列选自A1 蛋白多肽序列的片段， 所述A1 蛋白多肽序列具 有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 优选的， 所述A1蛋白多肽序列的片段为两种以上； 和/或， 所述跨膜结构域的蛋白多肽序列选自NKG2D蛋白多肽序列的片段， 所述NKG2D蛋 白多肽序列具有如SEQ  ID NO.2所示的核苷酸序列； 和/或， 所述共刺激信号结构域包括2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构， 所述2B4胞内区 结构的蛋白多肽序列选自2B4蛋白多肽序列的片段， 所述2B4蛋白多肽序列具有如SEQ  ID  NO.3所示的核苷 酸序列， 所述CD3ζ 胞内区结构的蛋白多肽序列选自CD3ζ 蛋白多肽序列的片 段， 所述CD3ζ 蛋白多肽序列具有如SEQ  ID NO.4所示的核苷酸序列。 3.根据权利要求2所述的能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体， 其特征在于包括 依次串联的胞外抗原结合结构域、 跨膜结构域、 2B4胞内区结构和CD3ζ 胞内区结构； 优选的， 所述嵌合抗原受体还包括标签序列， 所述标签序列连接于胞外抗原结合结构 域与跨膜结构域之间， 尤其优选的， 所述标签序列包括Myc ‑tag标签序列。 4.根据权利要求1所述的能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体， 其特征在于： 所述 能够特异性靶向肿瘤 细胞的嵌合 抗原受体的序列如SEQ  ID NO.5所示； 和/或， 所述的能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体蛋白的氨基酸序列如SEQ  ID  NO.6所示； 优选的， 所述肿瘤 细胞包括非小细胞肺癌A549细胞。 5.一种表达基因， 用于表达权利要求1 ‑4中任一项所述的能够特异性靶向肿瘤细胞的 嵌合抗原受体。 6.一种表达载体， 其特 征在于， 所述表达载体中含有如权利要求5所述的表达基因。 7.一种能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体修饰的NK细胞， 其特征在于， 所述NK 细胞中能够表达如权利要求1 ‑4中任一项所述的能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受 体， 或者所述NK细胞中导入了如权利要求5所述的表达基因， 或者所述NK细胞中转 染了如权 利要求6所述的表达载体。 8.根据权利要求7所述的能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体修饰的NK细胞， 其 特征在于： 所述 NK细胞包括 NK‑92MI细胞、 NK细胞或NK ‑92细胞。 9.一种药物组合物， 其特征在于包含作为有效成分的如权利要求1 ‑4任一项所述的能 够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体、 如权利要求5所述的表达基因、 如权利要求6所述 的表达载体、 或如权利要求7 ‑8中任一项所述的能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体 修饰的NK细胞； 优选的， 所述药物组合物还 包括药学上可接受的载体和/或赋 形剂。 10.如权利要求1 ‑4任一项所述的能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原 受体、 如权利要 求5所述的表达基因、 如权利要求6所述的表达载体、 如权利要求7 ‑8中任一项 所述的能够特 异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体修饰的NK细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备用 于治疗和/或预防肿瘤疾病的药物中的应用； 优选的， 所述肿瘤疾病选自肺癌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114249834 A 2能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合 抗原受体、 其表达基因、 其修 饰的NK细胞及应用 技术领域 [0001]本发明涉及 一种嵌合抗原受体， 特别是涉及一种能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合 抗原受体、 其表达基因及其修饰的NK细胞， 以及在肿瘤 治疗中的应用， 属于肿瘤免疫治疗技 术领域。 背景技术 [0002]嵌合抗原受体(Chimeric  antigen receptor， CAR)是一种受体蛋白， 它赋予免疫 细胞新的能力， 在肿瘤的免疫治疗中具有极具潜力的应用前景。 嵌合抗原受体包括抗原结 合结构域、 跨膜结构域和共刺激信号结构域。 它的细胞外抗原结合域通常为单链抗体 (scFv)， 可以识别肿瘤细胞表面的特异性抗原。 细胞内激活的信号结构域， 如CD28、 4 ‑1BB (CD137)和OX40， 通常起到触发免疫细胞激活和杀伤的作用。 近年来， 嵌合抗原受体修饰T细 胞(CAR‑T)在血液肿瘤 治疗中的应用取得了成功， 并成为肿瘤免疫治疗的临床热点。 截止目 前， 已经有5款CAR ‑T产品获得美国FDA批准上市， 用于治疗血液癌症。 2021年6月， 中国也迎 来了首款获批的CAR ‑T产品。 但是CAR ‑T的应用受到固有风险的限制， 例如， CAR ‑T会引起移 植物抗宿主病(GvHD)与细胞因子释放 综合征， 以及CAR ‑T的产生需要患者自体T细胞导致治 疗实施周期长等问题。 [0003]基于自然杀伤细胞(NK)细胞的特性， CAR ‑NK相比于CAR ‑T更具优势。 首先， CAR ‑NK 具有更好的安全性， 主要指以下几个方面： 1.由于NK细胞寿命很短， 避免了如T细胞持续存 在而引起的靶向效应； 2.同种异体NK细胞输注耐受性良好， 不会引起GvHD， 因此CAR在异体 NK细胞， NK92细胞系的应用成为可能， 表明NK是一种更好的CAR载体， 有望生产 “通用型”产 品； 3.由于NK细胞活化不产生促炎性因子， 因此几乎不会引起细胞因子释放综合征和神经 毒性等不良反应。 其次， NK细胞具有更强大的杀伤功能， 除了通过CAR结构识别激活NK细胞 发挥杀伤作用， NK细胞可通过表面各种受体识别配体从而杀伤肿瘤细胞， 此外NK细胞还可 通过CD16分子发挥 ADCC作用清除肿瘤 细胞， 表明CAR ‑NK具有更强大的杀伤能力。 [0004]CAR‑NK的应用中最关键的是靶点的选择， 目前现有的CAR结构中的胞外识别域一 般主要为单链 抗体(scFv)， 单链 抗体具有特异 性高的优点， 因此在CAR ‑NK中被广泛应用。 但 是获得有效靶向肿瘤的单链抗体时间长， 且难以获得， 存在单链抗体序列的获得工艺复杂， 耗时长、 现有 单链抗体对应的肿瘤 靶点较少等问题。 此外， 并且单链抗体具有分子量较大的 缺点， 因此较难将两个以上单链抗体构建成为多价的胞外识别域， 无法有效提高亲和力并 减少脱靶。 近年来有关CAR ‑NK技术的研究多使用单链抗体作为胞外识别结构域， Hsiang ‑ chi Tseng等人构建了靶向肝癌GPC3的CAR ‑NK， 证实了胞外信号可以转导激活NK细胞活化， 证实了NK9 2细胞系的能用性。 但更广泛的靶点选择仍是CAR ‑NK技术应用的难点。 发明内容 [0005]本发明的主要目的在于提供一种能够特异性靶向肿瘤细胞的嵌合抗原受体， 以克说　明　书 1/8 页 3 CN 114249834 A 3