(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111670833.5 (22)申请日 2021.12.31 (71)申请人 华东理工大 学 地址 200237 上海市徐汇区梅陇路13 0号 (72)发明人 曹旭妮　邢天舟　李昕茹　曾伟民　 杨云蛟　韩显洋　 (74)专利代理 机构 上海弼兴律师事务所 31283 代理人 钟华　黄益澍 (51)Int.Cl. C07K 14/47(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/18(2006.01) A61K 47/42(2017.01)A61K 49/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 蛋白纳米粒子的制备方法、 所得蛋白纳米粒 子及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种蛋白纳米粒子的制备方 法， 其包括如下步骤： 将一种 蛋白变性液进行离 子交换层析， 之后透析复性， 即得； 或者， 将多种 蛋白变性液分别进行离子交换层析， 再混合， 之 后透析复性， 即得； 所述蛋白变性液中的蛋白为 适用变复性方法的铁蛋白。 本发 明还公开了该方 法制得的蛋白纳米粒子， 以及该蛋白纳米粒子在 制备疾病诊断或治疗的制剂中的应用。 本发明的 方法可消除复性过程中易出现的多聚沉淀现象， 复性得率和纯度有显著提高， 具有较高的标记物 荷载能力。 权利要求书2页 说明书6页 序列表3页 附图3页 CN 114380901 A 2022.04.22 CN 114380901 A 1.一种蛋白纳米粒子的制备方法， 其特征在于， 其包括如下步骤： 将一种蛋白变性液进 行离子交换层析， 之后透析复性， 即得； 或者， 将多种蛋白变性液分别进 行离子交换层析， 再 混合， 之后透析复性， 即得； 所述蛋白变性液中的蛋白为 适用变复性方法的铁蛋白。 2.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述铁蛋白为融合铁蛋白， 较佳地为天 然蛋白修饰的铁蛋白或天然肽修饰的铁蛋白； 和/或， 所述铁蛋白为重组蛋白。 3.如权利 要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述蛋白变性液为EG  F::FTH1蛋白变性 液和/或HSA: :FTH1蛋白变性液； 较佳地为氨基酸序列如SEQ  ID NO:1所示的EGF::FTH1蛋白的变性液或氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示的HSA: :FTH1蛋白的变性液。 4.如权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述蛋白变性液由包涵体溶于含尿素的 变性液中变性制得， 所述包涵体通过破碎 表达菌体提取获得； 所述表达 菌体较佳地通过诱导表达工程菌表达蛋白后制得； 所述含尿素的变性液较佳地含8M尿素， 更佳地含8M尿素、 1mM  EDTA、 10mM  DTT和50mM   Tris‑HCl， pH7.9； 所述变性的温度较佳地 为26‑30℃， 更佳地为28℃； 所述变性的时间较佳地 为10‑24h， 更佳地为过夜。 5.如权利要求1或3所述的制备方法， 其特征在于， 所述离子交换层析为阳离子交换层 析或阴离 子交换层析， 较佳地 为DEAE阴离 子交换层析柱。 6.如权利要求5所述的制备方法， 所述离子交换层析的洗脱液为含氯离子的缓冲液， 较 佳地为含NaCl的缓冲液， 所述洗脱液的梯度浓度范围为20mM 至2M； 所述洗脱液的pH为5～14， 较佳地 为7； 更佳地， 所述洗脱液含NaCl和8M尿素的pH为7 的20mM Tris‑HCl缓冲液； 所述NaCl的梯 度浓度依次为20mM、 5 0mM、 100mM、 200mM、 400mM、 1M和2M； 收集含10 0mM NaCl的洗脱液； 每个梯度的洗脱液的用量较佳地 为8‑12个柱体积， 更 佳地为10个柱体积。 7.如权利要求3所述的制备方法， 其特征在于， 所述的混合按EGF::FTH1蛋白和HSA:: FTH1蛋白的摩尔比大于或等于1， 更佳地按6:4混合EGF::FTH1蛋白变性液和HSA::FTH1蛋白 变性液。 8.如权利要求1或3所述的制备 方法， 其特 征在于， 所述透析复性的透析液为含有梯度浓度的尿素的透析液， 较佳地含50mM三羟甲基氨基 甲烷、 50mM  NaCl、 0.5mM  EDTA、 0.1wt％聚乙二醇、 10wt％甘油、 0.2mM还原型谷胱甘肽和 0.1mM氧化型谷胱甘肽， 各步透析 液还含有浓度依次为 4M、 3M、 2M、 0M的尿素， pH7.9。 9.由权利要求1 ‑8任一项所述的制备 方法制得的蛋白纳米粒子； 所述蛋白纳米粒子较佳地为EGF/HSA ‑FTH1蛋白纳米粒子， 其中EGF:: FTH1蛋白和HSA:: FTH1蛋白的摩尔比大于或等于1， 较佳的为6:4， 所述EGF/HSA ‑FTH1蛋白纳米粒子的平均粒 径较佳地 为11.8nm±0.9nm。 10.如权利要求9所述的蛋白纳米粒子在制备疾病诊断或治疗的制剂中的应用； 所述疾病如肿瘤， 更 具体如乳腺癌；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114380901 A 2所述制剂可为靶向成像制剂或靶向药物载体， 具体如以EGFR为靶点的肿瘤成像制 剂或 肿瘤药物载体， 更 具体如EGFR高表达的乳腺癌的成像制剂或药物载体； 所述制剂的形式可为组合物或套装盒； 所述靶向成像制剂中， 所述蛋白纳米粒子的最小剂量较佳地 为1×10‑9mol/L。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114380901 A 3