(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202111663968.9 (22)申请日 2021.12.31 (71)申请人 西安桑尼赛尔生物医药有限公司 地址 710061 陕西省西安市高新区锦业路 瞪羚谷E座605 (72)发明人 彭作翰　刘佳玫　豆亚丽　刘敏　 李玏　 (74)专利代理 机构 中科专利商标代理有限责任 公司 11021 代理人 关旭颖 (51)Int.Cl. C12N 15/864(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 35/17(2015.01)A61K 39/00(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 31/18(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) A61P 37/02(2006.01) (54)发明名称 融合一代靶向CD7 CAR和二代靶向BCMA的双 靶点通用CAR-T细胞及制备方法 (57)摘要 本发明涉及融合一代靶向CD7  CAR和二代靶 向BCMA的双靶点通用CAR ‑T细胞及制备方法。 所 述方法包括： 将基因编辑物质递送至T细胞 以剪 切TRAC和CD7基因组DNA或剪切TRAC、 CD7和B2M基 因组DNA， 以及使用重组腺相关病毒递送模版DNA 以将靶向CD7 ‑BCMA双靶点CAR基因定点整合入 TRAC、 CD7或B2M基因组位点。 本发明的方法更安 全， 具有高细胞得率、 简易的工艺步骤和安全的 基因编辑方式， 并且所得的双特异通用型CAR ‑T 细胞具有更好的疗效。 权利要求书3页 说明书30页 序列表17页 附图13页 CN 114317607 A 2022.04.12 CN 114317607 A 1.一种制备靶向CD7和BCMA的双靶点通用型CAR ‑T细胞的方法， 所述方法包括： 将基因 编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和CD7基因组DNA或剪切TRAC、 CD7和B2M基因组DNA， 以及 使用重组腺相关病毒递送模版DNA以将靶向CD7 ‑BCMA双靶点CAR基因定点整合入TRAC、 CD7 或B2M基因 组位点。 2.根据权利要求1所述的方法， 所述方法还 包括： 递送所述基因编辑物质之前的T细胞激活， CAR‑T细胞扩增， 和/或 细胞冻存。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其中使用选自CRISPR ‑Cas9、 ZFN、 ARCRS、 TALEN和 megaTAL的基因编辑方法递送所述基因编辑物质， 优选 CRISPR‑Cas9； 所述基因编辑物质是质粒、 mRNA、 蛋白质、 慢病毒、 逆转录病毒、 腺病毒、 腺相关病毒， 优 选mRNA； 并且 递送所述基因编辑物质的方式包括使用脂质体、 磷酸钙、 DEAE ‑葡聚糖、 电穿孔、 显微注 射或基因枪的转染方法， 优选电穿 孔转染。 4.根据权利要求3所述 的方法， 其中CRISPR ‑Cas9基因编辑物质包括Cas9  mRNA或Cas9 蛋白和sgRNA， 优选地， sgRNA是化学修饰的， 其中化学修饰包括2 ‑O‑甲基化、 3 ‑硫代以及2 ‑O‑甲基化 结合3‑硫代， 优选地， 化学修饰发生在sgRNA的5 ’和3’端的1至10个碱基， 优选地， sgRNA的5 ’和3’端3个碱基同时进行2 ‑O‑甲基化和3 ‑硫代修饰， 优选地， 针对TRAC基因的sgRNA序列如SEQ  ID NO:1所示， 针对CD7基因的sgRNA序列如 SEQ ID NO:2所示， 针对B2M基因的sgRNA序列如SEQ  ID NO:3所示。 5.根据权利要求3所述的方法， 其中Cas9包括SpCas9、 SaCas9、 SpCas9 ‑HF、 eSpCas9、 xCas9和cpf1， 优选SpCas9， 更优选其氨基酸序列如SEQ  ID NO:4所示， 优选地， Cas9蛋白的N端或C端偶联有一个或多个NLS入核信号肽， 更优选地NLS入核信 号肽序列如SEQ  ID NO:5所示。 6.根据权利要求1或2所述的方法， 其中所述模版DNA包括左同源臂DNA、 敲入的外源 DNA、 右同源臂DNA。 7.根据权利要求6所述的方法， 其中左同源臂DNA和右同源臂DNA分别具有10至2000bp 的片段长度， 优选地3 00bp、 600bp或1000bp的片段长度， 优选地， 当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点时， 同源臂序列分别如SEQ  ID NO:6‑7 所示； 当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点时， 同源臂序列分别如SEQ  ID NO:8‑9所示； 当 双靶点CAR基因敲入B2M基因 组位点时， 同源臂序列分别如SEQ  ID NO:10‑11所示。 8.根据权利要求6所述的方法， 其 中当双靶点CA R基因敲入TRAC或CD7基因组位点时， 所 述敲入的外源DNA包含剪切肽或内部核糖体进入位点基因、 双 靶点CAR基因和polyA， 其中所 述剪切肽或内部核糖体进入位点基因选自P2A、 T2A和IRES， 优选P2A或T2A， 更优选P2A和T2A 的氨基酸序列分别如SEQ  ID NO:12‑13所示； 或者所述敲入的外源DNA包含外源启动子基 因、 双靶点CAR基因和po lyA； 当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时， 所述敲入的外源DNA包含双靶点CAR基因和权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114317607 A 2polyA， 或者所述 敲入的外源DNA包 含外源启动子基因、 双靶点CAR基因和po lyA； 优选地， 所述外源启动子选自EF1、 CMV、 PGK、 MSCV和SFFV， 优选EF1， 更优选地EF1的DNA 序列如SEQ  ID NO:14所示； 优选地， 所述polyA是miniPolyA或bGHpA  polyA， 优选地miniPolyA和bGHpA  polyA的 DNA序列分别如SEQ  ID NO:15‑16所示。 9.根据权利要求8所述的方法， 其中所述双靶点CAR基因包含通过剪切肽偶联的靶向 CD7 CAR基因和靶向BC MA CAR基因， 优选地， 所述靶向CD7  CAR基因包含信号肽、 靶向CD7抗体单链scFv、 铰链区、 跨膜区和 激活区， 优选地， 所述靶向BCMA  CAR基因包含信号肽、 靶向BCMA抗体单链scFv、 铰链区、 跨膜区、 共刺激区和激活区， 优选地， 所述剪切肽是P2 A或T2A， 更优选地P2 A的氨基酸序列如SEQ  ID NO:12所示。 10.根据权利要求9所述方法， 其中所述靶向CD7抗体单链scFv和所述靶向BCMA抗体单 链scFv的DNA序列分别如SEQ  ID NO:17‑18所示。 11.根据权利要求9所述方法， 其中所述信号肽选自CD8、 IL ‑2和GM‑CSF信号肽结构域， 优选CD8信号肽， 更优选 CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ  ID NO:19所示； 所述铰链区选自IgG1、 IgG4、 IgD和CD8铰链结构域， 优选CD8铰链结构， 更优选CD8铰链 结构的氨基酸序列如SEQ  ID NO:20所示； 所述跨膜区选自CD3、 CD4、 CD5、 CD8、 CD9、 CD16、 CD22、 CD27、 CD28、 CD33、 CD37、 CD45、 CD64、 CD80、 CD86、 CD134、 CD137、 CD152、 CD154或PD1跨膜结构域， 优选CD8跨膜结构， 更优选 CD8跨膜结构的氨基酸序列如SEQ  ID NO:21所示； 所述共刺激 区选自CD2、 CD7、 CD27、 CD28、 CD30、 CD40、 CD54、 CD83、 CD134、 CD137、 CD150、 CD152、 CD223、 CD270、 CD273、 CD274、 CD278、 CARD11、 NKD2C、 DAP10、 LAT、 SLP76、 ZAP70或4 ‑1BB 共刺激结构域， 优选4 ‑1BB共刺激结构， 更优选4 ‑1BB共刺激结构的氨基酸序列如SEQ  ID  NO:22所示； 所述激活区为CD3ζ激活结构域， 优选地CD3ζ激活结构域的氨基酸序列如SEQ  ID NO:23 所示。 12.根据权利 要求9所述的方法， 其中当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点时， 所述模 版DNA序列如SEQ  ID NO:24‑25所示； 当双靶点CAR基因敲入CD7基因 组位点时， 所述模版DNA序列如SEQ  ID NO:26‑27所示； 当双靶点CAR基因敲入B2M基因 组位点时， 所述模版DNA序列如SEQ  ID NO:28‑29所示。 13.根据权利 要求1‑12中任一项所述的方法制备的靶向CD7 ‑BCMA的双靶点通用型CAR ‑ T细胞。 14.根据权利要求13所述的靶向CD7 ‑BCMA的双靶点通用型CAR ‑T细胞用于制备药物的 用途， 所述药物用于治疗 疾病。 15.根据权利要求14所述的用途， 其中所述疾病包括白血病、 实体肿瘤和自身免疫疾 病， 优选地所述白血病选自急性B淋巴细胞白血病、 急性T淋巴细胞白血病、 NK/T细胞淋巴 瘤、 非霍奇金淋巴瘤、 慢性淋巴细胞白血病、 急性髓系白血病和多发性骨髓瘤， 特别是多发权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114317607 A 3