ICS 01.040.65 CCS B 16 34 安 徽 省 地 方 标 准 DB34/T 4198—2022 梨黑斑病菌的 LAMP 检测方法 Detection of Alternaria species involved in pear black spot using LAMP 2022 - 06 - 29 发布 2022 - 07 - 29 实施 安徽省市场监督管理局 发 布 DB34/T 4198—2022 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。 本文件由安徽省农业农村厅归口。 本文件起草单位：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所、巢湖市农机管理中心、安 徽省农业科学院园艺研究所、怀远县农业技术推广中心。 本文件主要起草人：杨雪、谷春艳、潘锐、翟承勋、徐会永、臧昊昱、戚仁德、高正辉、齐永杰、 王同岁。 I DB34/T 4198—2022 梨黑斑病菌的 LAMP 检测方法 1 范围 本文件规定了梨黑斑病菌的 LAMP 检测方法。 本文件适用于梨黑斑病菌检测的组织和人员。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 梨黑斑病 pear black spot 由链格孢类（Alternaria spp.）真菌引起的一种重要病害，已报道病原菌主要包括Alternaria gaisen K. Nagan、A. alternata (Fr.) Keissler、A. tenuissima (Fr.) Wiltsh、A. infectoria、 A. yaliinficiens R. G. Roberts 和 A. ventricosa R. G. Roberts。 4 方法原理 根据梨黑斑病病原菌的 cytb 序列设计的特异性引物进行 LAMP（Loop - mediated isothermal amplification, 环介导等温扩增技术）检测作为判断梨黑斑病菌的依据。 5 仪器设备 高速离心机：转速≤15000 r/min 涡旋振荡器 恒温金属浴 光照培养箱：20℃～30℃ 超低温冰箱：-80℃ 电泳仪 凝胶成像仪 可调移液器：1-10 μL，10 μL-100 μL，100 μL-1000 μL 6 试剂和培养基 1 DB34/T 4198—2022 培养基 WA 培养基（琼脂粉 20 g，加水 1000 mL），PDA 培养基（去皮马铃薯 200 g，蔗糖（或葡萄糖） 20 g，琼脂粉 20 g，加水补足至 1000 mL）。 DNA 提取试剂 2％ CTAB 提取液（100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2％ (w/v) CTAB，40 mmol/L 巯基乙醇（用时加入）），无水乙醇，10％ SDS，酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)，氯仿， 异丙醇，TE（10 mmol/L Tris-HCL (pH 8.0)，1 mmol/L EDTA）。 LAMP 检测试剂 Bst DNA 聚合酶，甜菜碱（Betaine），显色剂 SYBR Green I，TAE 电泳缓冲液 (Tris 4.84 g， Na2EDTA·2H20 0.75 g，冰乙酸 1.142 mL，加水至 1000 mL，pH 8.5)，琼脂糖。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB/T 6682 中三级水的标准。 7 检测方法 病原菌分离与纯化 将梨病果用 75％乙醇表面消毒 30 s 后，于病健交界处取少量组织置于 WA 培养基中 28℃培养。 待长出菌丝后，切取一小块放在 PDA 培养基中于培养 7 d 左右，收集菌丝于 4℃备用。 供试 DNA 提取 7.2.1 CTAB 法：取少量菌丝粉，加入 900 μL 2％ CTAB 提取液和 90 μL 10％SDS，涡旋混匀，于 60℃ 水浴 1 h，期间每隔 10 min 上下颠倒几次。常温条件下 12000 rpm 离心 10 min；取上清，加入等体 积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，常温条件下 12000 rpm 离心 5 min；将上清转移至新的 EP 管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，常温条件下 12000 rpm 离心 5 min；上清转移至新 EP 管 中，加入 1 倍于上清体积的异丙醇，-20℃条件沉淀 15 min；常温条件下 12000 rpm 离心 5 min，倾 去上清，沉淀用 70％乙醇洗涤 2 次，37℃条件下待乙醇挥发干；加适量灭菌超纯水或者 TE（pH 8.0） 溶解沉淀（含 20 μg/ml RNase），37℃消解 30 min 后电泳检测，-20℃保存备用。 7.2.2 试剂盒法：采用市售真菌 DNA 提取试剂盒，按照相应操作说明书提取 DNA 备用。 所用引物 所用引物设计参见附录A.1。 F3：5’- GGCTCCTTTGAATGGTAAC -3’； B3：5’- TGTCTTCAACCAAGCATCA -3’； FIP：5’- CGCTGCAAGTAATCTATAAATCGGATTCAATAGGCAAATGGGGA -3’； BIP：5’- AATGGATCAAGAACGTTCAACGAATTGGTTGTGGGGTACTC -3’。 检测体系 LAMP 扩增反应体系总体积为 20 μL，由下列浓度体积的组分组成： 名称 浓度 加入量 F3 10 μM 0.6 μL B3 10 μM 0.6 μL 2 DB34/T 4198—2022 FIP 40 μM 0.6 μL BIP 40 μM 0.6 μL MgCl2 25 mM 3.2 μL Betaine 4 M 1.6 μL dNTPs 10 mM 2.0 μL Bst DNA聚合酶 8 U/μL 0.8 μL 10×ThermoPol 2.5 μL DNA 模板 40 ng /μL 1 μL 用无菌双蒸水补充扩增体系体积至 20 μL，65℃保温 60 min。 8 结果判定 LAMP 扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果： a) 向扩增产物中加入显色剂 SYBR Green I，轻晃混匀，观察颜色变化；如果 LAMP 扩增产物显示 黄绿色，表明含有梨黑斑病菌；如果扩增产物为橙红色，表明不含有梨黑斑病菌（参见附录 A.2）。 b) 取扩增产物在 3％琼脂糖凝胶电泳中低压电泳，观察扩增条带；如果电泳图谱为梯状条带，表 明含有梨黑斑病菌；如果电泳图谱无扩增条带，表明不含有梨黑斑病菌（参见附录 A.3）。 3 DB34/T 4198—2022 附 录 A （资料性） 实验结果参考图 A.1 引物设计示意图 见图A.1。 图A.1 A.2 LAMP 产物凝胶电泳图 见图A.2。 标引序号说明： M：2000 bp； 泳道 1、2、6：表示含有链格孢菌； 泳道 3、4、5：表示不含链格孢； N：阴性对照。 图A.2 4 DB34/T 4198—2022 A.3 LAMP 产物显色图 见图A.3。 标引序号说明： 1、2、6：表示含有链格孢菌； 3、4、5：表示不含链格孢； N：阴性对照。 图A.3 5