ICS 65.020.01 CCS B 05 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2734—2022 向日葵总 DNA 快速提取及检测技术规程 Technical code of practice for rapid extraction and detection of total sunflower DNA 2022-07-29 发布 2022-08-29 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2734—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。 本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古农业大学、内蒙古工程项目管理有限公司、 内蒙古自治区农牧业技术推广中心、五原县农牧业技术推广中心、内蒙古自治区发展和改革委员会、巴 彦淖尔市农牧业科学研究所、内蒙古大学、杭锦后旗农牧和科技局。 本文件主要起草人：郭树春、李素萍、张艳芳、孙瑞芬、邵盈、于海峰、刘慧、李丽君、李二珍、 段宇坤、聂惠、乔慧蕾、牟英男、张勇、张晓蒙、梁晨、张聪子、李有良、张立华、刘锦川。 I DB15/T 2734—2022 向日葵总 DNA 快速提取及检测技术规程 1 范围 本文件规定了向日葵总 DNA 提取、质量检测和保存等技术内容。 本文件适用于向日葵根、茎、叶DNA的快速提取。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 DNA 提取量及质量目标 单位样本DNA提取量不低于0.8 µg～1.2 µg，DNA提取纯度A260 /280 值在1.8～2.0之间。 5 药品准备 药品准备见附录A。 6 DNA 提取 样品准备 取向日葵4～8叶期的叶片、根、茎80 mg～120 mg。 样品研磨 1.5 mL离心管加入样品，液氮制冷，用磨砂尖头玻璃棒迅速研磨成粉末。 DNA 抽提 DNA a) b) c) 抽提方法： 离心管中加入 700 µl 2%CTAB 提取液（药品配制见附录 A）； 将离心管置于 65 ℃水浴锅中 1 h，期间每隔 10 min 轻轻摇动一次； 取出后冷却至室温，然后加入 700 µl 氯仿/异戊醇（24∶1）轻轻转动摇匀后静置 10 min。 离心沉淀 离心沉淀方法： 1 DB15/T 2734—2022 a) b) c) d) e) 4 ℃下 10000 rpm 离心 6 min； 缓慢吸取上清液加入到预先加好 700 µl 无水乙醇的离心管中，轻轻的上下颠倒混匀； 放入 4 ℃冰箱冷却 30 min； 10000 rpm 离心 1 min； 缓慢倒掉全部液体，1 mL 70%的乙醇漂洗固态 DNA 2 次，10000 rpm 离心 1 min，弃上清液。 风干纯化 将6.4得到的沉淀物在超净工作台下风干，加入1×TE 100µl（1µl 10 mg/ml RNase）溶解DNA，在 37 ℃水浴中水浴1 h去除RNA。 DNA 浓度和质量检测 紫外分光光度计测定DNA浓度，并将其稀释到20 ng/µl，取5µl稀释液，以DL2000 marker为对照， 1%琼脂糖凝胶电泳检测。具体检测方法见附录B。 7 保存 DNA质量检测合格后，-20 ℃储存备用。 8 注意事项 DNA提取过程中注意事项： ——加入 CTAB 后轻轻摇匀，防止基因链断裂； ——操作过程中，全程佩戴医用口罩和专用手套。 2 DB15/T 2734—2022 A A 附 录 A （资料性） 溶液配制 A.1 2% CTAB 溶液配制：CTAB 4 g，Nacl 16.364 g，1 M Tris-HCI 20 ml (PH8.0)，0.5 M EDTA 8 ml，先用 70 ml ddH20 溶解，再定容至 200 ml 灭菌。 A.2 1 M Tris-HCI 溶液配制：Tris6.06 g，加 40 ml ddH20 搅拌溶解，冷却后加浓盐酸约 2.1 ml 调 PH 至 8.0，定容至 50 ml。 A.3 0.5 M EDTA(pH8.0)50 ml 的配制：称取 9.306 g EDTA-Na2·2H20，加入超纯水 35 ml，剧烈搅拌， 用约 1 g NaOH 颗粒调 pH 至 8.0，定容至 50 ml(EDTA 二钠盐需加入 NaOH 将 pH 调至接近 8.0 时，才会 溶解)。 A.4 10×TE：取 5 ml 1 M Tris-HCI，1 ml 0.5 M EDTA，加入 44 ml 超纯水后高压灭菌，室温保存。 取 1 ml 10×TE，加入 9 ml 灭菌后的超纯水即为 1×TE。 -1 A.5 5×TBE：称取硼酸 27.5 g，Tris 54 g，并且将 20 mL 的 0.5 mol·L EDTA（pH=7.9）置于其中， 加入 ddH2O 定容至 1 L。取 1 倍的溶液加入 9 倍的 ddH2O，即为 0.5×TBE。 3 DB15/T 2734—2022 B B 附 录 B （资料性） 1%琼脂糖凝胶电泳检测 1%琼脂糖凝胶电泳检测方法： a) 制备 1%琼脂糖凝胶（大胶用 70 ml 小胶用 50 ml)：称取 0.7 g（0.5 g）琼脂糖置于锥形瓶 中，加入 70 ml（50 ml）0.5×TBE。微波炉加热煮沸 3 次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成 1% 琼脂糖凝胶液； b) 胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。将内槽置 于水平位置，在固定位置放好梳子，将冷却到 65 ℃左右的琼脂糖凝胶液均匀小心地倒入内槽 玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，室温下静置直至凝胶完全凝 固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添 0.5×TBE 电泳缓冲液至没过胶板为止； c) 加样：在点样板上混合 DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液最终稀释倍数应不小于 1 X，用 10 μl 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以 防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）； d) 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压 60 V～100 V，样品由负极（黑色）向正极（红 色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约 1 cm 处时，停止电泳； e) 现察照相：在紫外灯下观察，DNA 存在则显示出条带，采用凝胶成像系统拍照保存。 4