DB35 ICS 11.220 B 41 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1929—2020 鸭瘟抗体间接 ELISA 试剂盒检测技术规范 Detection technical specification of indirect ELISA test kit for duck plague antibody 2020 - 09 - 29 发布 福建省市场监督管理局 2020 - 12 - 29 实施 发 布 DB35/T 1929—2020 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 疫病简述 .......................................................................... 1 4 原理 .............................................................................. 1 5 主要仪器 .......................................................................... 1 6 主要试剂 .......................................................................... 1 7 试剂盒的组成、组装和保存 .......................................................... 2 8 试剂盒的要求 ...................................................................... 3 9 样品的采集、保存与运输 ............................................................ 4 10 试剂盒操作步骤 ................................................................... 4 11 结果判定 ......................................................................... 5 附录 A（规范性附录） 相关试剂的配制 .................................................. 6 参考文献 ............................................................................. 8 I DB35/T 1929—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业农村厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建省动物疫病预防控制中心、福州市动物 疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：陈珍、傅光华、刘道泉、刘荣昌、黄瑜、史惠、吴波平、陈翠腾、陈冬群、 陈秀明、施少华、朱春华、刘斌琼、蔡国漳。 II DB35/T 1929—2020 鸭瘟抗体间接 ELISA 试剂盒检测技术规范 1 范围 本标准规定了鸭瘟抗体间接ELISA检测试剂盒的检测技术规范。 本标准适用于鸭血清中鸭瘟抗体的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682—2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 疫病简述 鸭瘟（duck plague，DP）又称为鸭病毒性肠炎，俗称“大头瘟”，是由鸭瘟病毒引起的一种急性、 高度致死性传染病，不同日龄的鸭均易感染。特征病变为食道、小肠和泄殖腔粘膜出血、坏死、溃疡， 病程稍长者食道和泄殖腔粘膜表面形成黄白色伪膜。该病传播迅速、发病率和死亡率高，广泛流行于我 国华南、华中和华东地区。 4 原理 本标准是针对鸭瘟抗体间接ELISA试剂盒建立的检测技术规范。工作原理为：当鸭血清中鸭瘟抗体 阳性时，在间接ELISA抗体反应过程中，鸭血清中的鸭瘟抗体先与包被的纯化鸭瘟病毒结合，形成抗原 抗体复合物，随后与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鸭IgG相结合，加入显色剂显色，置450 nm波长 下测定光密度值（OD450），通过分析其P/N值判定鸭血清中鸭瘟病毒抗体的水平。 5 主要仪器 所使用的主要仪器如下： a) 酶标仪（具有 450 nm 波长滤光片）。 b) 37 ℃±1 ℃恒温箱。 c) 96 孔酶标板。 d) 振荡器。 e) 可调微量移液器：包括多道（10 µL、100 µL、300 µL）和单道等。 6 主要试剂 所使用的主要试剂如下： 1 DB35/T 1929—2020 a) b) c) d) 包被抗原：按照附录 A 中 A.1 配制。 标准阳性血清：按照附录 A 中 A.2 配制。 标准阴性血清：按照附录 A 中 A.3 配制。 参考品：阳性参考品（通过中和试验和本试剂盒检测均为阳性）20 份，阴性参考品（通过中 和试验和本试剂盒检测均为阴性）20 份，每份参考品分装为每支 15 µL 装于无菌离心管中， 做好标记，置于-70 ℃±5 ℃保存备用。 e) 酶标二抗：HRP 标记的羊抗鸭 IgG。 f) TMB 显色液：TMB 含量为 200 µg/mL。 g) 碳酸盐缓冲液：按照附录 A 中的 A.4 配制。 h) 20×PBS 溶液：按照附录 A 中的 A.5 配制。 i) 稀释液：按照附录 A 中的 A.6 配制。 j) 洗涤液：按照附录 A 中的 A.7 配制。 k) 终止液：按照附录 A 中的 A.8 配制。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682—2008中一级水的要 求。 7 试剂盒的组成、组装和保存 7.1 试剂盒 A 的组成 7.1.1 标准阴性血清，10 µL，清亮、无溶血。 7.1.2 标准阳性血清，10 µL，清亮、无溶血。 7.1.3 酶标二抗，10 µL，无色透明液体。 7.2 试剂盒 B 的组成 7.2.1 7.2.2 7.2.3 7.2.4 7.2.5 7.2.6 包被好的酶标板，3 块，每个酶标板最大检测待检样品份数为 90 份。 磷酸盐缓冲液（20×PBS），100 mL，无色透明。 TMB 显色液，10 mL/瓶×3 瓶，无色透明，棕色瓶装，避光保存。 终止液，40 mL，无色透明。 吐温-20，500 µL，无色透明。 操作说明书，1 份。 7.3 试剂盒的组装 7.3.1 本试剂盒由试剂盒 A 和试剂盒 B 组成。 7.3.2 试剂盒外包装上应标明产品名称、包装规格、生产单位、生产批号、生产日期、有效期、产品 标准编号、注册编号和保存条件。 7.3.3 各组分均应贴上标签（内容包括：组分名称、生产日期、数量、保存条件）。 7.4 试剂盒的保存 试剂盒A于-20 ℃±1 ℃条件下保存，试剂盒B于2 ℃～8 ℃条件下保存。 2 DB35/T 1929—2020 8 试剂盒的要求 8.1 物理检查 8.1.1 外观：各组分外包装应完好、品名清晰。 8.1.2 试剂盒：各组分应齐全、完整，液体无渗漏、澄清透明无沉淀。 8.2 阳性参考品的符合率 按试剂盒操作说明书对阳性参考品进行检测，检测结果与阳性参考品的符合率不低于95%。 8.3 阴性参考品的符合率 按试剂盒操作说明书对阴性参考品进行检测，检测结果与阴性参考品的符合率不低于95%。 8.4 最低检测限 按试剂盒操作说明书对不同稀释度的标准阳性血清进行ELISA检测时，最低检测限为1:3 200。 8.5 批内差 按试剂盒操作说明书对阴阳性参考品进行检测，取10个不同试剂盒平行检测，计算检测结果的平均 值M和标准差SD，根据式（1）计算变异系数CV，CV不宜高于10%。 CV  SD  100% ..................................... (1) M 式中： CV——变异系数； SD——测量结果的标准差； M ——测量结果的平均值。 8.6 批间差 取3个批次的试剂盒（每批次10个），对阴阳性参考品进行检定，计算30次检测结果的平均值M和标 准差SD，根据式（1）计算变异系数CV，结果不宜高于10%。 8.7 有效期 试剂盒的有效保存期为12个月。 8.8 稳定性 8.8.1 效期稳定性：取贮存条件下保存 13 个月的试剂盒， 按 8.2～8.5 方法进行检测， 结果应符合 8.2～ 8.5 的要求。 8.8.2 稳定性试验：取贮存条件下保存 3 月、6 月、9 月和 12 月的试剂盒，按 8.2～8.5 方法进行检测， 结果应符合 8.2～8.5 的要求。 3 DB35/T 1929—2020 9 样品的采集、保存与运输 9.1 样品采集 采集鸭翅静脉血0.5 mL～1.0 mL，37 ℃±1 ℃恒温箱静置1 h后转入2 ℃～8 ℃条件下静置2 h～ 4 h，析出液体即为待检血清。 9.2 样品保存 置于-20 ℃±1 ℃条件下贮存备用，使用前2 h取出解冻，避免血清反复冻融。若分离的血清需当 天使用，则放置2 ℃～8 ℃条件下备用。 9.3 样品运输 血清样品应在-20 ℃±1 ℃条件下运输。 10 试剂盒操作步骤 10.1 试剂均衡 用前TMB显色液、终止液和磷酸盐缓冲液应取出室温均衡30 min。 10.2 试剂配制 从试剂盒B中取出20×PBS溶液、吐温-20，按照附录A中A.6和A.7配制1×PBS工作液和PBST工作液。 10.3 加样 从试剂盒B中取出酶标板，试剂盒A中取出标准阴性血清和标准阳性血清。待检血清标准阴性血清和 标准阳性血清用1×PBS按1:100倍稀释后加入酶标板中，每孔加入1