ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2741—2022 间接 ELISA 方法检测羊溶血性曼氏 杆菌抗体 Indirect ELISA for detection of antibody of sheep mannheimia haemolytica 2022-07-29 发布 2022-08-29 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2741—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本文件由内蒙古畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。 本文件主要起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：张月梅、赵世华、宋越、白帆、王娜、戴伶俐、张帆、杨斌、刘威。 I DB15/T 2741—2022 间接 ELISA 方法检测羊溶血性曼氏杆菌抗体 1 范围 本文件规定了应用间接ELISA检测羊溶血性曼氏杆菌抗体的方法。 本文件适用于羊溶血性曼氏杆菌PlpE蛋白抗体检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 酶联免疫吸附试验 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 以固相载体吸附技术和免疫酶技术相结合建立的一种检测方法，通常在合适的载体上，酶标记抗体 或抗原与相应的抗原或抗体形成酶标记的抗原-抗体复合物，在一定底物参与下，复合物上的酶催化底 物，使其水解、氧化或还原成另一种带色物质，酶的降解底物和呈现色泽成正比，可以使用酶标仪进行 测定，从而计算出参与反应的抗原或抗体的种类和含量。 辣根过氧化物酶 horse radish peroxidase，HRP 与碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）常被用于免疫酶技术中的抗体或抗抗体的标记，而 形成仍保持免疫学活性和酶活性的酶标记物，进而催化底物产生水解、氧化或还原反应，最终生成可溶 或不可溶有色物质。 溶血性曼氏杆菌 mannheimia haemolytica，Mh 巴氏杆菌科曼氏杆菌属的微生物，球杆状或短杆状菌，两端钝圆，革兰染色阴性，典型两端深染， 中间浅，单个或成双存在，无鞭毛，有荚膜，不形成芽孢。 3,3’,5,5’ -四甲基联苯胺 tetramethylbenzidine，TMB 用于酶联免疫吸附试验（ELISA）的可视化试剂。其可在辣根过氧化物酶（HRP）的催化下发生颜色 变化。 1 DB15/T 2741—2022 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 isopropyl-β-d-thiogalactoside，IPTG 一种作用极强的诱导剂，它可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。 吐温-20 tween-20 一种非离子型表面活性剂。 卡那霉素 kanamycin 一种蛋白质生物合成抑制剂，从卡那霉素链霉菌（Streptomyces kanamyceticus）中分离得到。 吸光度 optical density，OD 表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示。 4 试剂 羊溶血性曼氏杆菌 PlpE 蛋白 阳性血清 分离鉴定并经测序确定为溶血性曼氏杆菌的菌液制备全菌灭活抗原，并用其免疫3月龄羔羊制备标 准阳性血清，经间接血凝实验验证为阳性。 阴性血清 无母源抗体，经间接血凝实验结果为阴性。 酶结合物 HRP标记的抗羊IgG抗体，工作浓度参照所购产品说明书。 碳酸盐包被液 称取碳酸钠1.0 g和碳酸氢钠3.0 g，溶于800 mL超纯水，调节pH值为9.4～9.6，用超纯水定容至 1000 mL。 磷酸盐缓冲溶液 称取磷酸二氢钾0.24 g，磷酸氢二钠1.42 g，氯化钠8.0 g，氯化钾0.2 g，超纯水800 mL溶解后， 调整pH值为7.4，超纯水定容至1000 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。 封闭液 称取脱脂乳5.0 g，溶于100 mL磷酸盐缓冲液中。 2 DB15/T 2741—2022 洗涤液 向PBS溶液中添加0.05% Tween-20，即每1 L PBS中添加500 μL Tween-20，混匀后室温保存。 稀释液 量取5.0 mL马血清溶于95.0 mL PBS中。 底物液 A 称取TMB 200.0 mg，无水乙醇（或二甲基亚砜）100 mL，加超纯水至1000 mL。 底物液 B 十二水合磷酸氢二钠14.60 g，柠檬酸9.33 g，0.75%过氧化氢6.4 mL，调pH值为5.0～5.4，加超纯 水至1000 mL。 终止液 量取5.6 mL浓硫酸（18 mol/L）与94.4 mL超纯水混合，冷却至室温保存。 TSA 称取胰酪胨15.0 g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0 g，氯化钠5.0 g，超纯水1000 mL，混合，微热溶 解，调节pH值为7.3，加入15.0 g琼脂，加热融化后，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，冷却至约60 ℃，在 无菌操作条件下倾注约20 mL至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。制备好的培养基宜在2 ℃~8 ℃ 保存。 TSB 称取胰酪胨15.0 g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0 g，氯化钠5.0 g，超纯水1000 mL，混合，微热溶 解，调节pH值为7.3，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。制备好的培养基宜在2 ℃~8 ℃保存。 LB 液体培养基 称取胰酪胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，超纯水1000 mL，混合，微热溶解，调节pH 值为7.3，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。制备好的培养基宜在2 ℃~8 ℃保存。 LB 固体培养基 称取胰酪胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，超纯水1000 mL，混合，微热溶解，调节pH 值为7.3，加入15.0 g琼脂，加热融化后，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，冷却至约60 ℃，在无菌操作要 求下倾注约20 mL至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。制备好的培养基宜在2 ℃~8 ℃保存。 5 仪器与设备 恒温培养箱：37 ℃。 酶标仪。 天平：称量范围 0 g~500 g，读数精确度 0.01 g。 恒温摇床：37 ℃。 低温离心机。 3 DB15/T 2741—2022 微量移液器(10 μL、200 μL、1000 μL)和配套吸头。 多道移液器(300 μL)。 酶联反应板。 血清稀释板（96 孔一次性 U 型血凝板或 96 孔细胞培养板）。 冰箱。 一次性采血器(5 mL，10 mL)。 6 血清样本的处置 样本采集及处理 血液样本采集时，每只羊用一个采血器，通过颈静脉采集静脉血，每次采血不少于4 mL，45°倾斜 采血器室温静置2 h，待血液凝固后，将其放入冰箱2 ℃~8 ℃ 3 h后，4000 r/min离心10 min，用移 液器小心吸出上层血清。 样本存放及运送 血清样本若在一周内进行检测，可在冰箱中2 ℃~8 ℃保存，如果超过一周检测，应将样品置于20 ℃保存，测试前应将样本提前恢复至室温。运输过程注意冷藏，可将采集的血清样本用冰袋、保温 桶或车载冰箱进行运输，应尽量缩短运输时间，确保样品有效。按照《兽医实验室生物安全技术管理规 范》进行生物安全标识。 7 方法 包被抗原的制备 7.1.1 重组载体的构建 将溶血性曼氏杆菌分离菌株划线接种于5%马血清的TSA培养基，连续划线3次，挑取大小适中的单菌 落接种于含5%马血清TSB培养基中，于37 ℃培养12 h~16 h后，用细菌DNA提取试剂盒提取全菌DNA。 以该DNA为模板，PlpE-F/PlpE-R为引物（附录A）扩增PlpE基因片段，将纯化后的基因片段和pET28b原核表达载体分别用Nde I和Xho I限制性内切酶酶切，经连接酶连接并转化于大肠杆菌感受态细胞 后涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基，经37 ℃培养过夜，挑取单菌落经LB培养基培养后，提取质粒。 随后对质粒进行双酶切、测序鉴定，确定成功构建PlpE-pET-28b原核表达载体。 7.1.2 目的蛋白的纯化 将含有质粒PlpE-pET-28b的大肠杆菌原核表达载体在含有终浓度为100 μg/mL卡那霉素的LB固体 培养基上划线，37 ℃培养过夜后挑取单个菌落，接种于添加有终浓度为100 μg/mL卡那霉素的LB培养 基中，37 ℃振荡培养过夜。 将菌种液以1：100的比例接种于新鲜的含100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，置于摇床中37 ℃ 振荡培养至OD600为0.6，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，继续培养4 h，离心收集菌体，将菌体沉淀悬 浮于PBS中，经超声波裂解菌体细胞，12000 r/min，4 ℃，离心20 min后收集上清液体，将上清液体通 过0.45 μm滤膜，过滤去除杂质。然后将处理好的细菌诱导裂解样品经镍柱亲和层析纯化。BCA法测定 纯化的蛋白浓度。 7.1.3 目的蛋白的检测 4 DB15/T 2741—2022 PlpE蛋白通过BCA法测定蛋白质浓度。按照Western blot实验步骤用DAB显色试剂盒显色，分析在相 应位置出现的蛋白条带。 ELISA 检测 7.2.1 包被：将目的蛋白用 0.05 mol/L、pH 值为 9.6 的碳酸盐缓冲液(CBS)稀释为 0.25 μg/mL，按 100 µL/孔加入至酶联反应板，置 4 ℃冰箱过夜，次日甩掉包被液，用 PBST 洗涤酶联反应板 3 次。 7.2.2 封闭：用移液器按 300 µL/孔向酶联反应板加入新鲜配制的封闭液，37 ℃恒温箱孵育 1 h；取 出后加 PBST 洗板 3 次。 7.2.3 加样：用 PBS 按体积比 1:100 稀释待检血清、阳性、阴性对照血清，稀释后血清 100 µL/孔， 37 ℃恒温箱孵育 1 h，用 PBST 洗板 3 次。吸取不同血清时需要更换洗头。 7.2.4 加酶结合物：取稀释好的酶结合物，酶联反应板 100 µL/孔加注，37 ℃恒温箱孵育 30 min，洗 涤同前。 7.2.5 加底物显色：将底物液 A 和底物液 B 等体积混合制成的 TMB 底物显色液按 100 µL/孔加注，室 温避光作用 20 min，用 1 mol/L H2SO4 按 100 µL/孔加入酶联反应板，终止显色反应。 7.2.6 数据读取：用酶标仪在波长 450 nm 处测定每孔的吸收值，每个样品每次平行 2 孔，取其平均 值。 判定标准的确定 在已经确定的间接ELISA条件下